印遇龙院士：天然植物替代饲用促生长抗生素的研究与展望
中国工程院院士印遇龙研究员就天然植物在替抗领域研究与应用中存在的问题、评价方法、替抗机制、有效成分及应用领域、未来发展方向提出了建设性意见。
饲用促生长抗生素（antibiotic growth promoters）是指添加于饲料中既有促生长又有预防动物疾病用途的抗生素，但根据农业农村部公告第194号和第246号之规定，不包括抗球虫和中药类抗生素。饲用促生长抗生素（以下简称“抗生素”）在养殖业作为药物饲料添加剂使用可追溯到20世纪50年代，在过去数十年间曾成为动物健康的保障，并发现给动物饲喂低剂量的抗生素可以刺激生长。抗生素在饲料养殖中的应用使我国的畜禽产品从奢侈品发展成为日常消费品，其历史功绩不可否认。但由于利益的驱使，超量、超时（休药期不停药）、超范围及叠加用药等抗生素滥用现象时有发生，并随着研究和应用的深入，抗生素滥用的一系列弊端逐渐被暴露。抗生素会在动物体内及其产品中的残留直接威胁人类健康，尤其是在饲料中添加这种长期低剂量的摄入方式更易产生具耐药性的超级细菌。有研究表明，我国大型养猪场的猪粪、猪粪堆肥和施用堆肥的土壤样品中检测到63种抗性基因丰度显著高于没有施用抗生素的对照样品。说明抗生素滥用将导致抗生素抗性基因的富集，严重影响生态环境，并导致这些抗性基因转移到人类致病菌中，最终危害人类健康。
滥用抗生素的危害自21世纪初引起了世界各国高度重视，欧盟、日韩和美国等发达国家先后出台政策全面禁止在饲料中添加抗生素。据世界卫生组织的报道，世界每年消耗的抗生素总量90%用于食源动物，其中又有90%是为了提高饲料转化率；我国每年生产抗生素约21万吨，其中有10万吨用于畜禽养殖业。随着人民群众对肉品质与健康的诉求日益迫切，农业农村部于2019年7月发布第194号公告，要求在2020年底前退出除中药外所有促生长类药物饲料添加剂品种。这一公告宣示了中国饲料端进入了无抗时代，也意味着替代抗生素（以下简称“替抗”）的政产学研工作将成为饲料禁抗后时代畜牧领域的重点工作方向。
1 替抗策略与天然植物
饲用抗生素禁用后综合应对策略既包括建立动物福利与环境友好的养殖体系，还包括无抗饲料配方和开发新型的抗生素替代品，而理想的替抗产品应具备这些特征：①自身无毒副作用且无体内残留；②不产生环境污染和细菌耐药性；③在饲料和消化道中稳定；④对正常菌群无害且杀灭致病菌；⑤提高动物免疫力及生产性能；⑥不显著增加成本。
1.1 抗生素替代物的评价方法
目前，随着饲用抗生素替代产品研究的发展，市场上替代抗生素的产品出现品种、功能的多样化，在促进畜禽生长和健康、改善畜产品品质等方面具有一定功效，在畜禽养殖中主要的抗生素替代物有益生菌、抗菌肽、酶制剂、多糖和植物提取物等。对这些抗生素替代物的评价手段包括：①采用组学技术（基因组学、蛋白组学和转录组学等）阐明作用机制，确定抗生素替代品对动物的多靶点作用，探究替代物的主要功能和辅助功能，从而更好的配伍不同的替代物；②优化常规动物生产评价方法，建立多种体外模型开展抗生素替代的技术研究，研发体内动物模型与体外检测技术相结合的安全评价方法体系，筛选早期生物标志物和敏感标志物，建立有效性和安全性评价及健康生长性能评估的系统评价；③根据诊断、预后疗效及安全性评价抗生素替代物，用高通量实验手段测定它们在体内含量的动态变化，并通过建立数学和计算机模型来试图模拟这些变化对细胞、组织、器官和动物机体整体的影响。
例如，胃肠道是动物与各种食物、营养物质、药物、毒素和细菌反应的主要部位，因此胃肠道的稳态对维持动物的健康至关重要。在单胃动物肠道健康的最新研究成果表明，孕烷X受体（PXR）广泛分布在猪小肠，激活PXR可以缓解由脂多糖引起的腹泻，PXR激活后可以使细胞抵御大肠杆菌和沙门氏菌的侵染，通过考察物质对激活PXR的能力，作为筛选潜在的饲用抗生素替代物的标准。本实验室通过构建荧光标记的重组质粒猪肠道PXR细胞，分别用激动剂（利福平）和抑制剂（酮康唑和克霉唑）检验其活性，并建立PXR受体激活剂高通量筛选模型，该研究通过动态监测重组质粒猪肠道PXR细胞荧光强度，并在浓度梯度下筛选十余种植物提取物。筛选结果发现鱼腥草等多种植物提取物具有和利福平相当的PXR激活效果，以此筛选维护猪肠道健康的活性物质，据此进一步展开饲养试验验证。
传统的2D细胞系或原代细胞难以再现动物体内器官（尤其是胃肠道）的生理功能，发展3D类器官利于宏观到微观相结合的探索性研究，还能显著缩短试验周期，大大减少为实验研究而牺牲的动物，类器官将成为动物医学和动物营养研究的有力平台。可在6d内建立的感染模型胃肠道类器官和3D立体生长的猪肝脏类器官也是研究抗生素替代物的良好模型。本实验室通过添加不同浓度的植物精油处理氧化应激后的肝脏类器官，通过检测其关键基因和蛋白的表达与定位、筛选代谢组和转录组差异代谢物与基因、敲除基因后对天然免疫的影响来研究植物精油的抗菌和抗病毒作用，以及相关抗氧化、发育和免疫功能的作用及其分子机制。
1.2 天然植物的替抗机制
在科学系统的评价方法下，天然植物及其提取物因其资源丰富、来源广泛、功能全面、安全性高、副作用小、不易产生耐药性、残留少等独特优势，受到了广大学者和从业人员的青睐。天然植物在替抗机制上主要分为直接抑菌作用和增强免疫机能。
1.2.1 直接抑菌作用
大部分观点认为抗生素的生长促进作用的根本原因来自对微生物的直接干预，抗生素的抗菌机制作用于细胞壁、核酸等（如β-内酰胺类抗生素主要抗菌机制是阻碍细胞壁的正常生成），对病原菌选择压力大，易诱导耐药性。新抗生素研发的速度远不及耐药性发生和发展的速度，终将导致人类和动物无药可用。因此，药物不仅依赖于对病原菌本身的抑制或杀灭作用，也依赖于对其毒力因子的干预作用。以毒力因子为靶标的抗生素替代物研发将成为重点，其中天然植物（中草药）因其低毒副作用、低残留耐药性和确切的疗效而受到格外关注。作为保健药品同时兼有促生长、无毒性的特点，符合当今全社会日益关注的无残留、绿色健康的呼声，应用前景十分广阔。
与各类合成的抗生素不同，天然植物的核心抑菌机制以病原菌的毒力因子为靶标，降低细菌的耐药性及致病力，使得宿主的免疫系统更高效地清除病原菌而发挥其干预感染过程的作用效果，从而对病原选择压力较之抗生素更小，不易产生耐药性，抗生素与天然植物的特征比较见表1。
以上特点表明，与抗生素单一稳定相比，天然植物的抑菌机制更倾向多靶点/多成分的“整体概念”，故对于治疗复杂疾病或机体紊乱方面更具备安全性和有效性。实际上，这与西医理念中的全身系统生物学（whole-body systems biology）相似，将人或动物视为一个复杂的超有机体，由宿主细胞和共生微生物组成，采用自上而下的策略，在全身背景下反映超有机体的突现功能。中医药从整体角度关注征兆和表征，通过四诊八纲辩证施治的方式，根据差异化对患者进行区分；而全身系统生物学通过多元统计模式对血液、尿和粪便样进行组学分析，以生物标志物对患者进行分层。二者在诊断及愈后、功效安全性评价、新药开发和细胞与分子机制具有一致性，运用“中医整体理论+西医明确成分”的理念对中草药现代研究具有前瞻性的指导作用。
1.2.2 增强免疫机能
天然植物与传统抗生素的区别在于保健功效，即通过提高机体自身的免疫力，全面提升动物的健康状态，预防动物疾病，从而提高生产性能并改善产品品质。天然植物可能通过在病原体感染前调控机体免疫功能，从而最大程度减轻损伤性炎症反应和诱导保护性机制，成为应对耐药菌的可持续解决方案。抗生素对病原体无节制的刺激可能导致慢性炎症，这对畜禽生产来说无疑会对生产性能造成很大的影响，因为免疫过程中会将大量的必需营养素优先供给相关系统的代谢活动，用于补充受损和坏死组织及免疫细胞的增殖。因此，天然植物可在清除病原体和防止动物胃肠道面临大量抗原持续炎症反应维持平衡，减轻和预防过度炎症，将有利于动物生产。天然植物增强免疫机能的作用机制主要在于恰如其分的调节，越来越多的证据表明，天然植物在降低顽症和自身免疫性疾病风险方面的作用，源于它们具有强大的抗氧化作用和调节炎症反应机制。
2 天然植物类型及在替抗中的应用
2.1 植物功能成分类型
天然植物的生物活性得益于内含多种类型的植物功能成分，这些成分按照化学结构可分为多酚类、精油（挥发油）类、多糖类、萜类和生物碱类等类别，在养殖领域既有共性也有特性，以下对畜禽中研究和应用较多的几种类别作简要阐述。
2.1.1 植物多酚
植物多酚（polyphenols）是一种广泛分布于植物的次生代谢产物，在结构上具有多个酚羟基而得名。酚羟基是多酚类具有生物活性重要原因之一，但因结构比较复杂可将多酚视为一个大类，再细分为酚酸类、黄酮类、单宁、木酚素、芪二烯等，数百年来被用于治疗感染，不仅具有抗菌活性，还具有抗氧化、抗炎和抗癌作用。目前在动物生产中研究应用较多的有绿原酸、茶多酚和白藜芦醇等，植物多酚通常与糖苷或有机酸结合，在植物中已经发现十万种以上多酚类化合物，这些化合物在整个进化过程中改变了它们的多样性，成为许多不同分子靶点的配体，从而产生高分子杂乱性。植物多酚抑菌作用机制多样，对于以细胞壁为首，脂膜、膜受体和离子通道、细菌代谢产物均为多酚作用位点，例如没食子儿茶素、没食子酸酯（EGCG）能结合至少73种不同的蛋白聚合，从而导致菌壁降解，包括青霉素结合蛋白(PBPs)、转运蛋白(包括ABC转运蛋白、PTS系统转运蛋白和磷酸盐ABC转运蛋白)等。植物多酚对已产生高耐药性的细菌也有积极作用，如对内酰胺类抗生素(如青霉素)的滥用使得耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）进化出β-内酰胺酶，降低了对这类抗生素的亲和力。尽管如此，天然高分子原花青素仍然在亚最低抑菌浓度下强烈抑制了MRSA，降低了细胞膜的稳定性和β-内酰胺酶活性。
2.1.2 植物精油
植物精油（essential oil）是以植物为原料提取的有特征气味的植物源次生代谢产物，通常是由压榨法、溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、超临界萃取等方法提取的挥发油和烯萜类物质，呈油状液体且通常具有挥发性。目前在动物生产中研究应用较多的有牛至油、香芹酚、百里香酚、肉桂醛、柠檬油、辣椒油等，具有调节酶活，保护肠道绒毛，提高饲料转化效率，抑制有害微生物生长，刺激有益微生物繁殖，以及提高肉的抗氧化能力和储存时间等功效。植物精油通过破坏细胞质膜的完整性来使细菌性病原体致死，细胞质膜的破坏进一步会引起内环境pH和无机离子的失衡，进而导致质子原动力的衰竭和ATP的损耗。针对革兰氏阴性菌更有效。其抗氧化作用机理是基于它可以贡献一个氢离子或电子给自由基的能力，以及它们在芳香结构中使未配对电子去配位的能力，从而保护其他生物分子不被氧化。
2.1.3 植物多糖
植物多糖（polysaccharides）是一类从植物中合成的，至少由10个以上单糖及单糖衍生物通过脱水缩合形成的高分子碳水化合物。多糖不仅是动物细胞构成的结构物质和营养需要的能源物质，还具有抗菌、抗病毒、抗感染、抗肿瘤和调节免疫等多种生理功能。目前在动物生产中研究应用较多的有黄芪多糖、白术多糖、牛膝多糖等。值得注意的是，不仅在传统意义上的药用植物，在非药用植物中也有大量多糖在动物生产中的应用，例如海藻多糖、苜蓿多糖等。多糖结构与宿主细胞上受体结构相似，能有效阻断细菌与宿主结合。与菌体细胞结合后通过静电作用使细胞膜、细胞壁损坏或变形，导致菌体内外物质通透。多糖还能靶向作用于细菌DNA，影响其复制、转录和翻译进程，而从抑制毒力因子的形成。
2.1.4 其他活性物质
此外，植物活性成分还包括有机酸类和生物碱类等，当前《兽药品种目录》中仅有的两种中药类药物——山花黄岑提取物散的主要成分是以绿原酸为代表的植物有机酸，博落回散的主要成分是以血根碱为代表的生物碱。绿原酸的抗菌的作用源于增大细菌胞膜通透性和抑制其新陈代谢相关酶活。血根碱可以有效平衡畜禽肠道微生物菌群，不仅能选择性抑制有害微生物，对畜禽上常用的益生菌的最小抑菌浓度则远小于正常使用浓度。
2.2 天然植物在替抗生产中的应用
21世纪以来，在国内外饲料禁抗政策驱动下，引导了天然植物作为饲料添加剂完全或部分替代饲用抗生素的一系列研究。从大多数结果来看，多种类型的植物提取物能够在替代抗生素的前提下，不影响或改善养殖动物的生长性能、抗氧化能力、肠道形态、菌群结构或免疫功能。
2.2.1 猪
Ding等研究发现在断乳仔猪饲料中添加杜仲提取物可代替硫酸黏杆菌素和吉他霉素，与对照组相比腹泻率下降，平均日增重（ADG）上升，提升了血清和肝脏中碱性磷酸酶（AKP）和总抗氧化能力（T-AOC），肠道中胰蛋白酶和脂肪酶活性上升。Kong等试验证明，刺五加提取物能有效替代的硫酸黏杆菌素在断奶仔猪的作用，并且提高了回肠氨基酸表观消化率。Cui等发现柑橘提取物能够替代金霉素不影响生产性能的前提下，促进了氨基酸的吸收和利用，改善了肠道形态和消化酶活性。Jimenez等发现在仔猪暴露于产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）的环境下，饲料中添加肉桂醛和有机酸能够代替硫酸黏杆菌素，减轻由ETEC引起的各脏器组织学病变，提高肠道中绒毛高度及绒毛高度和隐窝深度比，肠道和肝脏中谷胱甘肽（GSH）和铁离子还原抗氧化能力（FRAP）上升，硫代巴比妥酸值（TBARS）下降。
2.2.2 鸡
Guo等发现青蒿水提取物作为金霉素的替代品，可提高肉鸡的生长性能和抗氧化功能，提高了过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的抗氧化相关酶活，以及对应的mRNA表达量提高，并经测定表明其有效成分为黄酮类。柴毛毛等研究发现在饲粮中添加博落回提取物可有效代替那西肽和金霉素，降低了料肉比，提高了盲肠中总短链脂肪酸、乙酸和丁酸含量，改变了盲肠食糜中菌群的构成，上调了盲肠肠道屏障功能相关的基因表达量。Okti等研究表明薰衣草精油可以替代维吉尼亚霉素在肉鸡中抗炎促生长作用，提高了体重和饲料转化率，提高了SOD和GSH-Px酶活，降低了氧化产物丙二醛（MDA）含量，减少了回肠和盲肠中有害菌的数量。
2.2.3 牛
犊牛疾病除了会直接致死之外，也会长期对生长性能造成影响，其中有56%是因为消化道问题或腹泻产生的，因此犊牛健康维持也是可持续畜牧业发展的一大挑战。柏妍等研究发现牛至精油和莫能菌素对荷斯坦犊牛具有相似的效果，牛至精油能提高血清中SOD、GSH和GSH-Px的浓度以及瘤胃球菌属在瘤胃中的数量。
3 天然植物发展方向
国内外对于天然植物的研究取得了一定进展，也在生产中体现了一些优势，但受制于自身特性，仍然存在以下问题需要解决：①植物提取物成分复杂，物质基础不明确且作用机制不清晰；②与其他替抗物质的协同增效机制成疑，难以完全发挥天然植物自身的优势；③易受自然条件影响和工艺条件限制，产品品质不稳定且难以控制；④天然植物在饲用方向缺乏标准管理，无法进一步开拓国内外市场。对于上述研究和应用中存在的问题，提出下列解决办法。
3.1 研究方向
天然植物的替抗作用机制仍有待深入研究，早日跳出成分不清、机理不明和质量不稳的窘境。天然植物易受自然条件的影响，例如采收季节、地域、采收部位等因素影响，成分和药效难以稳定，并且而伴随种植过程中农药、化肥使用缺乏监管，可能导致产品本身重金属、农残超标。世界上现存植物约60万种，但做过化学及药理研究的还不到10%。我国对天然植物的药用历史之悠久、经验之丰富居世界前列，但对其化学和药理的研究却落后于一些发达国家。研究范围应从传统的萜类、生物碱类等向更为复杂的聚醚类、大环内酯类、前列腺素类、超级碳链化合物以及生物活性内源性物质（如多糖、多肽等）延伸，天然植物的研究将从分子水平切入，而进入更高层次的发展。
植物提取物的生物利用度往往不高，需加强对于载体和加工工艺的研究。例如进食后未被保护的精油（如香芹酚、百里香酚、肉桂醛、丁子香酚等），在动物的胃及肠道前段被迅速吸收，不能达到肠道后端。因此，直接饲喂未保护的精油到达肠道后端实现抑菌的作用很难实现。气味大、影响适口性；易挥发、热稳定性差；加工后损失大定点释放的包被技术可以避免精油挥发，延长储存时间，降低饲料加工过程中的损失，并且可以帮助精油到达消化道的不同部位并发挥其生物活性。本课题组利用离子成胶技术，以藻酸盐、乳清蛋白和氯化钙为包被材料成功的研发了定点释放的微胶囊技术。使天然精油能在动物消化道的不同位置定点释放。
3.2 应用方向
天然植物开发重心可放在非药用部位及副产物，利用现代工艺进行改良。天然植物药渣即中草药经过炮制或溶剂提取后剩余的残渣（前提是不得有毒有害），限于提取条件，药渣中往往仍含有半数左右的生物活性成分，这些药渣的生物产量高达亿吨计，如不对其充分利用开发，不仅浪费了巨量的宝贵资源，还将严重污染生态环境。这些中草药药渣未提取的有效成分主要存在于细胞壁中，传统提取工艺难以将其完全利用。利用液体发酵、固体发酵、药用真菌双向性固体发酵等生物转化技术，不仅能将其中的功能成分充分释放，而且还能进行营养改性，使其中的营养物质更易被动物吸收，是今后应用的一大热点。
制订天然植物饲料原料及其粗提物相关标准将成为后续工作重点之一。我国农业农村部目前规定了117种天然植物可以直接作为饲料原料使用，且包括经过水提或醇提的粗提物。然而在强制性标识一栏仍处于空缺状态，换言之，这百余种可饲用天然植物在畜牧行业尚未有可用的标准。致使在生产实践中不利于产业的精细分工、产品交易、企业的提质增效，也不利于进出口贸易规范发展。可饲用天然植物标准制订工作应遵循不与人争药材、少设技术门槛、接轨国际标准、先试行再修订的原则，以《中国药典》、《兽药典》作参考，制订符合畜牧行业特点的天然植物标准。
研发复配型替抗物将成为今后实践生产的重点，包括中医药方的改进和多类替抗物复合应用。单一植物精油在饲料里应用存在着气味单调、诱食性一般、免疫功能短缺、杀菌不完全等缺陷，而通过多种复配精油，能很大程度规避这些问题。通过调控复配精油的配伍，能改变复配精油的抗菌谱，扩大致病菌的抑杀范围，维持肠道内的有益菌群。此外，植物提取物应与酸化剂、酶制剂、益生菌等替抗物组合使用，起到一加一大于二的应用效果，展开研究此类复配型替抗物的协同作用机制，进一步降低添加量和耐药性，从而维持这些添加剂的应用药效。
4 小结
抗生素长期滥用危及动物健康、破坏生态环境，最终威胁人类健康，饲用端禁抗与替抗工作已是板上钉钉。在明确替抗产品目标和建立替抗评价体系之后，天然植物因其直接抑菌作用和增强免疫机能的双重作用机制功效，得到了学界和市场的认可。因为可饲用天然植物大多数也是药食同源的中药材，其安全性和资源优势成为替抗策略中的重点研究对象。不仅如此，天然植物在畜牧领域全面的功能，源于其功能活性成分的多样性，且它们之间或与其他类型的替抗物质往往能产生协同作用。经过试验表明，多种植物提取物均可基本替代抗生素以用于抵御致病菌的侵袭，同时对畜禽的生长性能、抗氧化能力、肠道形态、菌群结构或免疫功能产生积极效应。与此同时，我们也应当看到天然植物在理论研究和生产应用中尚存的问题，亟待构建科研院校与龙头企业的产学研联合创新体系攻坚克难。可以预见，天然植物源的饲料添加剂产品的研发、应用及推广将进一步落实无抗养殖方案，促进我国畜禽养殖业的健康、可持续发展。